溶藻弧菌探針?lè )晒舛縋CR試劑盒?使用方法

溶藻弧菌探針?lè )晒舛縋CR試劑盒使用方法：

一、稀釋PCR陽(yáng)性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽(yáng)性對照。

2. 標記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對照。放冰上待用。

7. 重復上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8. 如果有N個(gè)樣品，必須設置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽(yáng)性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬(wàn)拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當于10萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數病毒DNA提取試劑盒兼容。

三、設置qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果只做1次重復，則標記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對照，6個(gè)用于PCR陽(yáng)性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數量相應增加2或3倍。

11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽(yáng)性對照，并且陽(yáng)性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）