RT-PCR試劑盒的PCR反應及注意事項說(shuō)明

　　RT-PCR試劑盒是為兩步法RT-PCR一步實(shí)驗配制的，具有高靈敏度的RT-PCR反應系統，可以從極低量的總RNA或poly(A)+RNA合成一鏈cDNA。與PCR反應相結合，可用于檢測稀有基因的表達、從極少量細胞中定量檢測特定mRNA的表達水平、克隆特定基因的cDNA片段等。合理配備與cDNA一鏈合成反應相關(guān)的各種組分，該試劑盒有高效的逆轉錄酶活性，對后續的PCR或定量PCR實(shí)驗兼容性好，適合于各種PCR耐熱聚合酶。

　　RT-PCR試劑盒試驗時(shí)進(jìn)行的PCR反應：

　　1.吸取10%的一鏈反應液（2μl）進(jìn)行PCR反應；即使加入更多量的一鏈反應液也不能增加其擴增的產(chǎn)物量，反而可能會(huì )抑制正常的PCR反應；

　　2.94℃加熱變性2min；

　　3.設置15-40個(gè)PCR循環(huán)。退火與延伸條件依引物和模板而定。

　　相關(guān)注意事項：

　　1.用于cDNA合成反應的溶液試劑盡量可能用DEPC進(jìn)行處理，并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能高壓滅菌時(shí)，首先用經(jīng)過(guò)滅菌的器具、水等配制溶液后，再將溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌處理。

　　2.RNA樣品要避免基因組DNA污染。

　　3.避免多次反復凍融RNA，使RNA保持在冰浴中處融化狀態(tài)。

　　4.試劑盒的各組成成分應在-20℃保存。

　　5.cDNA產(chǎn)物應置于-20℃保存。