熒光-PCR法的相關(guān)數據處理常識要弄清

　　對熒光-PCR法的數據處理我們要了解一個(gè)關(guān)鍵的因素“Ct值”。在實(shí)時(shí)定量PCR的數據圖中，x-軸表示PCR循環(huán)數，y-軸表示擴增反應的熒光值，也就是擴增產(chǎn)物的量。這個(gè)圖中有基線(xiàn)、閾值、Ct值這幾個(gè)概念，從這幾個(gè)值我們能夠最終得到模板中目的基因的含量。

　　基線(xiàn)是擴增曲線(xiàn)中的水平部分。在反應初階段，雖然產(chǎn)物是指數級增長(cháng)，但是由于總量太少，其熒光處于背景水平，檢測不到熒光增加。因此基線(xiàn)信號的產(chǎn)生是由于測量的偶然誤差引起的。然而當累積了足夠的擴增產(chǎn)物，足以產(chǎn)生可檢測的熒光信號時(shí)，這個(gè)信號的值就被稱(chēng)為閾值，通常閾值默認為基線(xiàn)信號的標準偏差×10。在閾值的前后，PCR的反應仍然是指數級增長(cháng)的，因此此時(shí)的PCR結果可靠，可以準確地反映體系中模板的初始量。Ct值是信號強度達到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數，也就是擴增曲線(xiàn)與閾值的交叉點(diǎn)。

　　為什么知道了Ct值就能夠得到初的目的基因含量呢？

　　一個(gè)基因的單次反應擴增曲線(xiàn)中要計算擴增產(chǎn)物的分子數N，它等于模板的分子數乘以1+擴增效率的n次方，n代表循環(huán)次數。也就是說(shuō)，如果擴增效率為100%，產(chǎn)物分子數就等于模板數乘以2的n次方。但是顯然，在線(xiàn)性增長(cháng)期和平臺期，擴增效率不可能是100%，因此上述PCR理論方程只在指數期成立。