熒光-PCR法的主要理論依據說(shuō)明

 　　熒光-PCR法是通過(guò)熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標記跟蹤，實(shí)時(shí)在線(xiàn)監控反應過(guò)程。PCR擴增時(shí)加入一對引物和一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個(gè)報告熒光基團和一個(gè)淬滅熒光基團。探針完整時(shí)，淬滅基團抑制報告基團的熒光發(fā)射。剛開(kāi)始時(shí)，探針結合在DNA任意一條單鏈上，PCR擴增時(shí)，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，報告基團與淬滅基團發(fā)生分離，抑制作用被解除，從而熒光監測系統可接收到熒光信號。隨著(zhù)PCR反應的進(jìn)行，反應產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強度信號，這樣就可以通過(guò)熒光強度變化監測產(chǎn)物量的變化，結合相應的軟件對產(chǎn)物進(jìn)行分析進(jìn)而得到一條熒光擴增曲線(xiàn)。熒光擴增曲線(xiàn)分熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期三個(gè)階段。指數期的PCR產(chǎn)物量的對數值與起始模板量之間存在線(xiàn)性關(guān)系，因此我們選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析，計算出待測樣品初始模版的量。