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細菌專(zhuān)用蛋白酶抑制劑混合液反應五要素

更新時(shí)間:2022-03-01點(diǎn)擊次數:606

細菌專(zhuān)用蛋白酶抑制劑混合液反應五要素:

參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物:引物是PCR特異性反應的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則:

①引物長(cháng)度: 15-30bp,常用為20bp左右。

②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長(cháng)至10kb的片段。

③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過(guò)多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會(huì )形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基,特別是最末及倒數第二個(gè)堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn), 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn), 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無(wú)明顯同源性。

引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以引物量產(chǎn)生所需要的結果為好,引物濃度偏高會(huì )引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會(huì )。

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TEL:021-61210612

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