狼源性成分探針?lè )晒舛縋CR試劑盒?檢測方法步驟

狼源性成分探針?lè )晒舛縋CR試劑盒檢測方法步驟：

(1)將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品，并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線(xiàn)；

(2)待測樣本與步驟(1)所述標準品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標準曲線(xiàn)計算各自的拷貝數，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數比值，即得目的基因的拷貝數相對定量檢測結果。

其中步驟(1)為：將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品，并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線(xiàn)。

其中所述參照基因為本領(lǐng)域常規參照基因，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴增區域，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為T(mén)A cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標準品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標準品中待測目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對標準曲線(xiàn)法應用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問(wèn)題，提高HER2基因擴增檢測的可靠性。

步驟(2)為：待測樣本與步驟(1)所述標準品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標準曲線(xiàn)計算各自的拷貝數，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數比值，即得目的基因的拷貝數相對定量檢測結果。

其中所述待測目的基因為本領(lǐng)域常規待測目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴增區域，所述熒光定量PCR擴增為本領(lǐng)域常規熒光定量PCR擴增方法，所述熒光定量PCR擴增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴增。

NRK-52E，大鼠腎細胞

H9c2大鼠心肌細胞（ATCC來(lái)源）

C2C12, 小鼠肌原細胞

NIH/3T3, 小鼠成纖維細胞系

大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）

HSC-T6, 大鼠肝星狀細胞系

CHO, 中國倉鼠卵巢細胞系

COS-7L, 非洲綠猴腎成纖維細胞

SF9, 昆蟲(chóng)卵巢細胞

BRL 3A, 大鼠肝正常細胞

HK-2, 人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞

HET-1A, 人食管上皮細胞

RGC-5, 小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節細胞

GC-1, 鼠精原細胞

293A，人胚腎上皮細胞系（腺病毒包裝級別）

hDPSCs, 人前磨牙牙髓干細胞

293T, SV40轉化的人胚腎上皮細胞系

EPC, 大鼠血管內皮祖細胞

HBE, 正常人支氣管上皮細胞系

HL-02 [L-02,HL-7702], 正常人肝上皮細胞

HUVEC-12, 人臍靜脈血管內皮細胞系

HUM, 正常人主動(dòng)脈平滑肌細胞

HAVSMC, 人主動(dòng)脈平滑肌細胞

LX-2, 人肝星形細胞株

3T3-L1, 小鼠前脂肪細胞