乳突類(lèi)圓線(xiàn)蟲(chóng)PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)

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注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時(shí)間；4．循環(huán)次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
8-Hydroxyhyperforin 8,1-hemiacetal無(wú)乙 GR,99%乙酸銫  AR,99% metals basis

9R-10alpha-Hydroxyepigambogic acid鹽酸  用于痕量分析, ≥37% (T)乙酸銫  99.9% metals basis

9S-10alpha-Hydroxyepigambogic acid氧化鋅 99.999% metals basis乙酸銫  99.99% metals basis

11-Hydroxyjasmonic acid五氧 AR,95%無(wú)氯化鋰 AR,99.0%

12-Hydroxyjasmonic acid2,2-偶氮二(2-甲基基咪) 97%乙酸鋅，二 AR,99.0%

30-Hydroxygambogic acid偶氮二異戊 98%氧化鋅 AR，99%

Acetamide, N-[1,1-bis[(acetyloxy)methyl]-3-(4-octylphenyl)propyl]-五硫化二銻 銻含量:66%硫酸鋅,七  99.995% metals basis

Agomelatine乙酰胺 AR,99%堿式碳酸鋅 AR,57.5%

Allicin乙酰胺 Standard for GC,≥99.5% (GC)硫酸銅，五 高純級

Allitol乙酰胺 99.8%，升華純化磺酸 70%溶液

Allura Red AC硝酸鋁 九合物 AR,99.0%硫酸鎳，七  GR，99%

alpha-L-Rhamse三氯化銻 AR，99%溴化鎳 22.5%溶液

Amphotericin B五銻 CP（）溴化鎳 99%

Alpha-Angelica lactone酮 96%（）氯化鎳,六 AR，98%

Arachidonic acid皂土(膨潤土) Bentone SD-1，適于中至低極性溶劑三氧化二鈷 CP,98.5%

Aristolochic acid B磷酸三鈣 CP,97%三氧化二鈷 AR,99.0%

乙二胺四乙酸鋅二鈉 四合物Phospho-AMPKα1 (Ser485) (45F5) Rabbit mAbPhospho-beta-Arrestin 1(Ser412)  磷酸化β抑制蛋白1抗體

石蕊eIF3A AntibodyPhospho-Bcr(Tyr360)  磷酸化T淋巴細胞受體抗體

甲基橙(IND)Calpain 2 Large Subunit (M-type) AntibodyPhospho-Bcr(Tyr177)  磷酸化T淋巴細胞受體抗體

甲基紅鈉鹽(IND)HDAC2 Antibodyphospho-Bcl-xL/BCL2L1(Thr115)  磷酸化Bcl-xL蛋白抗體

甲基紅鈉鹽(ACS reagent,95 %)Phospho-Paxillin (Tyr118) Antibodyphospho-Bcl-xL/Bcl2L1 (Ser62)  磷酸化Bcl-xL(Ser62)抗體

間甲基紅Paxillin AntibodyPhospho-Bcl-2(Thr129)  磷酸化Bcl-2抗體

紫脲酸銨(IND)PSMD2 (D6W7G) Rabbit mAbPhospho-Bcl-2(Ser70)  磷酸化Bcl-2抗體

紫脲酸銨(ACS)Phospho-cdc2 (Thr14) AntibodyPhospho-Bcl-2 (Thr56)  磷酸化Bcl-2抗體

甲基紫,龍膽紫Phospho-FGF Receptor 1 (Tyr766) (1E5) Rabbit mAbphospho-Bcl 10(Ser218)  磷酸化Bcl-10抗體

間酚PKCβII (D9S2U) Rabbit mAbphospho-BCAR1(Tyr410)  磷酸化癌抗雌激素耐藥蛋白1
乳突類(lèi)圓線(xiàn)蟲(chóng)PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)Cyclohexyl(dimethoxy)methylsilane,≥97...多肽試劑　25ML

Dimethoxydiphenylsilane,≥98.0%多肽試劑　25ML

Heptamethyldisilazane,≥97.0%多肽試劑　25ML

(3,3,3-Trifluoropropyl)methyldichloros...多肽試劑　5G

Potassium bromide多肽試劑　25G

Chlorotriethylsilane ,≥98.0%多肽試劑　25ML

Hexamethyldisilane,≥98.0%多肽試劑　10ML

3-Amipropyl(diethoxy)methylsilane, ...多肽試劑　50ML

N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylened...多肽試劑　100ML

n-Propyltriethoxysilane多肽試劑　25ML

3-(2-Amiethylami)propyldimethoxyme...多肽試劑　25ML

3-Chloropropyltriethoxysilane,≥98.0%多肽試劑　100ML

3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilane,≥...多肽試劑　25G

1,1,3,3-Tetramethyldisiloxane ,≥98.0%多肽試劑　25ML

Triacetoxy(methyl)silane ,≥90.0%多肽試劑　100ML