桃拉綜合癥病毒PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)

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注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時(shí)間；4．循環(huán)次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
3,4-DimethoxyphelN,N-二甲基對苯二胺 99%,用于過(guò)氧化物酶試驗硝酸 電子級

3,4-Dimethoxyphenyl beta-D-glucosideN,N-二甲基對苯二胺 AR，環(huán)保試劑,96%硫酸 AR,95-98%（）

3,4’-Di-O-methylellagic acid三十二烷 98%硫酸 99.999% metals basis

L-Alanine二苯氨基脲 AR四丁基磷酸二氫銨 98%

D-Alanine乙 for HPLC, >99.0%(GC)，含2%乙作穩定劑間氨基苯甲酸 99%

DL-Alanine二甲基黃 indicator對氨基苯甲酰胺 98%

β-Alanine砷試劑 AR,99.0%2,2-雙[4-(4-氨基苯氧基)苯基]烷 98%

BOC-L-Alanine1,2-二氯乙烷 standard for GC,>99.9%(GC)對氨基苯甲酸丁酯 98%

BOC-D-Alanine1,3-二氨基－4-(5-溴-2-吡啶偶氮)苯 AR雙(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)癸二酸酯 98%

L-Alanine ethlester hydrochloride2-(3,5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚 AR4,4'-雙(4-氨苯氧基)聯(lián)苯 97%

D-Alanil二乙氨基乙基纖維素-1 TLC2,2-二(3-氨基-4-羥苯基)六氟烷 98%

L-Arginine二甲基黃 分析標準品，≥98.0% (HPLC)3,3',4,4'-聯(lián)苯四甲酸二酐 97%

D-Arginine二十烷 standard for GC,>99%(GC)1,4-環(huán)己烷二羧酸(cis + trans) 99%

DL-Arginine二十烷 AR2,2'-二羥基-4-甲氧基二苯甲酮 98%

L-Arginine HCL二十烷  99%4、4'-二氨基苯酰替苯胺 98%

L-精氨酸琥珀酸鋇鹽二十烷 分析標準品，≥99.5% (GC)2,4-二羥基苯甲 98%

標準溶液（1000μg/ml,溶劑：）p35/25 (C64B10) Rabbit mAbPDXK  吡哆激酶抗體

標準溶液（100µg/mL,基體：）Acetyl-Histone H3 (Lys14) (D4B9) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)PDX1  胰島素促進(jìn)因子抗體（胰十二指腸同源異型盒蛋白）

鉍標準溶液（1000μg/ml,溶劑:1.5 mol/L H3）IKKα AntibodyPDSS2  抑癌蛋白DLP1抗體

鉍標準溶液（1000μg/ml,溶劑:1.0 mol/L H3）Phospho-Atg13 (Ser355) (D6J1W) Rabbit mAbPDPK1  3磷酸肌依賴(lài)性蛋白激酶1抗體

鈹標準溶液（1000μg/ml,基體:1.5 mol/L H3）PKCε (22B10) Rabbit mAbPDLIM3/ALP  輔肌動(dòng)蛋白相關(guān)LIM蛋白抗體

銅標準溶液（1000mg/l,溶劑：1%硫酸）IKKβ AntibodyPDLIM1  細胞骨架蛋白C端PDLIM1抗體

銅標準溶液（500mg/l,溶劑:1%硫酸）IKKγ AntibodyPdk4  酮酸脫氫酶激酶4抗體

鉻標準溶液（三價(jià)鉻標準溶液1000μg/ml）OGDH (E1W8H) Rabbit mAbPDK2  酮酸脫氫酶激酶亞型2抗體

鉻標準溶液（500mg/L,溶劑：）Phospho-IKKγ (Ser376) AntibodyPDIA2/PDI  蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶抗體

鉻標準溶液（100µg/mL,基體：）IKKε AntibodyPDI/P4HB/ERBA2L/PDIA3  蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶抗體
桃拉綜合癥病毒PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)Sodium D-pantothenate,99%通用試劑　5G

2,3,5-Triiodobenzoic acid,98%通用試劑　5G

γ-Lilenic acid,≥99%通用試劑　10MG

Humic acid通用試劑　10G

Amiphylline hydrate,98%通用試劑　25G

(2′Z)-Indirubin (HPLC,≥98%)通用試劑　5MG

α-Hydroxyisobutyric acid,99%通用試劑　5G

9,10-Phenanthrenequine,95%通用試劑　5G

12-Amilauric acid,95%通用試劑　5G

Kainic acid mohydrate,≥99%通用試劑　5MG

Cyclopentadienyl iron(II) dicarbonyl d...通用試劑　1G

N-Acetylsulfanilyl chloride,98%通用試劑　25G

3,4-Dimethoxybenzyl alcohol,96%通用試劑　5G

Benzamidine hydrochloride hydrate,≥99%通用試劑　5G

3-Hydroxyphenylacetic acid,≥99%通用試劑　1G