尤氏泰勒蟲(chóng)PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時(shí)間；4．循環(huán)次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

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實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
BOC-L-Homophenylalanine2,2′-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽 98%2-羥基-4-甲基吡啶 98%

BOC-D-Homophenylalanine腺苷-5′-三磷酸二鈉鹽，三 98%4-氨基苯甲酸甲酯 98.0%

Sodium Glycinate放線(xiàn)菌素D 98%（）2,4,6-三氯苯酚 98%

L-Prolil牛血清白蛋白 96%堿式乙酸鋁 AR

Creatine牛血清白蛋白標準溶液 0.5 mg/ml 標準溶液堿式乙酸鋁 CP

N-Acetyl-L-Valine考馬斯亮藍G250 AR，無(wú)蛋白酶四乙酸鉛 AR,90%

N-Acetyl-DL-tryp tophane二(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基) 99%磷酸 99.9%，8000目

N-Acetyl-glycine聚氧乙烯20油 average Mn ~1,150磷酸 99%

D-Tryptophan methyl ester hydrochloride聚氧乙烯月桂 高純級，Brij-351,2-二(二甲硅基)苯 98%

L-Cysteine methyl ester hydrochloride聚氧乙烯月桂 高純級，Brij-301，4-二（二甲基硅烷基）苯 97%

D-Phenylalanine methyl ester hydrochloride二(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基) 細胞與昆蟲(chóng)細胞培養級, ≥98%1，4-二（*基硅烷基）苯 96%

L-Alanine methyl ester hydrochloride烏苯美司 超純級，>99%芐基*基氫氧化銨 40%甲溶液

D-Alanine Methyl Ester Hydrochlorideγ-環(huán)糊精 98%,用于細胞培養1,4-二苯基丁二炔 99%

D-Proline methyl ester hydrochlorideγ-環(huán)糊精 98%堿式碳酸鎂 CP

L-Tyrosine methyl ester hydrochloride胞嘧啶 98%乙烯基-POSS 99%

D-Tyrosine Methyl ester hydrochloride醋酸纖維素 TLC、柱層析苯基-POSS 98.5%

2，4-滴酸(標準品)SCD1 (C12H5) Rabbit mAbPAP2B  磷脂酸磷酸酶2b抗體

2，4-滴酸(98%)AMPKα1 AntibodyPAP1/Acid Phosphatase  酸性磷酸酶抗體

二噻農(標準品)AMPKα1 AntibodyPan-ras  Pan ras抗體

棉隆(標準品)Lyn (C13F9) Rabbit mAbPANK4  泛酸激酶4抗體

雙氯酚(標準品)Lyn (C13F9) Rabbit mAbPANK3  泛酸激酶3抗體

異凈(標準品)ERp72 AntibodyPANK2  泛酸激酶2抗體

異菌脲標準溶液(100μg/ml,u=4%)Claspin AntibodyPANK1  泛酸激酶1抗體

異氯磷(標準品)PRSS15/LONP1 (D8W1J) Rabbit mAbPancreatic Lipase  胰脂肪酶抗體

1,4-二氯苯-d4(標準品)Survivin (6E4) Mouse mAbPancreatic Amylase  胰淀粉酶抗體

2,2,3,3,4,4,5,56,6-十溴代-1,1-聯(lián)苯(標準品)Acetyl-Histone H3 (Lys9) (C5B11) Rabbit mAb (PE Conjugate)pan methyl Lysine  泛甲基賴(lài)氨酸抗體
尤氏泰勒蟲(chóng)PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)Glycine sodium,98%通用試劑　25G

Sodium oleate,≥99%通用試劑　250MG

Sodium amide,95%通用試劑　25G

Sodium hydrogen difluoride,98%通用試劑　250G

4-Amibenzoic acid sodium salt,≥99%通用試劑　25G

Sodium dodecylbenzenesulfonate通用試劑　100G

Sodium stearate,≥99%通用試劑　1G

Sodium phelate,99%通用試劑　5G

Sodium benzenesulfonate,97%通用試劑　25G

Sodium salicylate,≥99.5%通用試劑　100G

Sodium malonate,≥97.0%通用試劑　25G

Sodium propionate,≥99.0%通用試劑　250G

Sodium oxalate,≥99%通用試劑　100G

Sodium hexafluoroaluminate通用試劑　100G

Sodium fluorosilicate通用試劑　100G