登革熱病毒Ⅱ型PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)

注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時(shí)間；4．循環(huán)次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
Platinum tetraiodide鈉標準溶液1.50mg/L,質(zhì)標樣2-羥并咪唑  97%

Platinum(IV) oxide鈉 CP,98.0%3,9-二(1, 1-二甲基-2-羥基乙基)-2,4,8,10-氧代螺旋[5.5]十一烷

Cadmium溴烯, 包含≤1000 ppm 氧化烯穩定劑, 98%(±)-3-羥基-r-丁內酯 96%

Cadmium1-溴戊烷 GR，99%鹽酸倍他司汀 99%

Cadmium bromide溴代十四烷 98%2-氯芐 99%

Cadmium carbonate1-溴代正己烷 99%6-氯-7-氮雜嘌呤 98%

Cadmium hydroxide溴代正丁烷 CP,98%乙酸乙酯 98%

Cadmium iodide1-溴代正辛烷 98%二乙氧基乙酸乙酯 97%

Cadmium sulfide1-溴-3-氯烷 99%3-甲?；?2-酸乙酯 97%

Cadmium acetate dihydrate溴代異丁烷 98%4-噁唑羧酸乙酯 97%

N-Acetylphenylhydrazine溴代叔丁烷, 包含0.5%碳酸穩定劑, CP乙二楊酸酯 98%

Hydrazine dihydrochloride溴代叔丁烷  >98.0%(GC)乙酸乙酯,甲苯溶液 50%甲苯溶液

Hydrazine mohydrochloride溴代正壬烷 97%羥基乙酰胺 98%

3-Hydroxy-2-naphthoic hydrazide溴代正癸烷 AR，98%乙酸 98%

Phenylhydrazine溴代十二烷 98%乙酸甲酯 98%

Antimony1-溴十八烷 97%二甲氧基乙酸甲酯 97%

二氯二茂鋯(>97.0%(T))IL-17A (D1X7L) Rabbit mAb (Mouse Specific) (PE Conjugate)IRS-3  胰島素受體底物-3抗體

Chirabite-AR[用于核磁共振]MRP3/ABCC3 (D8V8J) Rabbit mAbIRS-2  胰島素受體底物-2抗體

三(2,2,6,6-四甲基-3,5-庚二酮酸)鐠(III)(＞98%(T))Tuberin/TSC2 (D57A9) Rabbit mAbIRS1  胰島素受體底物-1抗體

三(2,2,6,6-四甲基-3,5-庚二酮酸)銪(III)(＞95%(T))FABP5 (D1A7T) Rabbit mAbIRS P53  胰島素受體底物p53蛋白抗體

三(6,6,7,7,8,8,8-七氟-2,2-二甲基-3,5-辛二酮基)鐠(Ⅲ)(>97.0%(T))FABP5 (D1A7T) Rabbit mAbIroquois homeobox protein 3  Irx3蛋白抗體

(S)-(+)-1,1'-聯(lián)萘基-2,2'-雙磷酸氫酯(>97.0%(T))Gα (pan) AntibodyIRGM  免疫相關(guān)鳥(niǎo)苷三磷酸酶基因抗體

(R,R)-(-)-2,3-丁二(>96.0%(GC))MAVS AntibodyIRF7  干擾素調節因子7抗體

(S,S)-(+)-2,3-丁二(>97.0%(GC))MAVS AntibodyIRF4  干擾素調節因子4抗體

(+)-芐甲苯基硅基乙酸(>98.0%(T))MSH6 (P150) AntibodyIRF3  干擾素調節因子3

(-)-芐甲苯基硅基乙酸(>98.0%(T))MSH6 (P150) AntibodyIRF-1/MAR1  干擾素調節因子1抗體
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檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。