魚(yú)特定基因序列PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)

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注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時(shí)間；4．循環(huán)次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
啶蟲(chóng)脒(標準品)Lck (D88) XP® Rabbit mAb2-氟磺?；?/span>

多菌靈(分析標準品,99%)Lck (D88) XP® Rabbit mAb亞酸二芐酯

(分析標準品,98%)Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Alexa Fluor® 647 Conjuga)嘧啶

鹽酸水蘇(標準品)CNPase Antibody羥基酰

異水飛薊賓(分析標準品,≥98%)Transthyretin (D8T4Q) Rabbit mAb甲基二甲基硅烷

3,3’-二沒(méi)食子酸酯茶黃素(分析標準品,≥98.0%(HPLC))RANS (R40) Antibody基-2-甲基吡啶

巴馬汀化物一水合物(分析標準品)RANS (P20) Antibody6-甲氧基-噠

BSA[=N,O-雙(*基硅基)酰](>75.0%(GC))RANS Antibody (Rodent Specific)2--6-甲氧基吡啶

TMS-BA[=N,O-雙(*基硅基)酰](25%的溶液)ASF1A (C6E10) Rabbit mAb2--甲氧基吡啶

BSTFA[=N,O-雙(*基硅基)三氟代酰](>95.0%(GC),用于氣相色譜)

Phospho-PDGF Receptor α (Tyr754) (23B2) Rabbit mAb2,6-二-羥基吡啶

TMS-咪唑(=N-*基硅基咪唑)(>98.0%(T))Phospho-PDGF Receptor α (Tyr754) (23B2) Rabbit mAb溴甲基環(huán)丁烷

N,O-雙(*硅基)酰(>75.0%(GC))Phospho-c-Jun (Thr93) Antibody3,5-二酸

N,O-雙(*基硅烷基)三氟酰(>95.0%(GC))CD14 (61D3) Mouse mAb (FITC Conjuga)基溴化鎂

N,O-雙(*基硅烷基)三氟酰,含1%*基硅烷（用于氣相色譜）Phospho-c-Jun (Ser243) Antibody鹽酸米帕明

*基硅烷(>98.0%(GC))Phospho-Tau (Ser199) Antibody咪唑-甲酸甲酯

1,1,1,3,3,六甲基二硅氮烷SimpleChIP® Mouse SLA2 Promor Primers3,9-二氮雜螺[5.5]十一烷-甲酸叔丁酯

N-甲基-N-*硅基酰(>92.0%(GC))SET8 (C18B7) Rabbit mAb甲酸-2,2,2-三酯

N-甲基-N-*基硅基三氟酰(>90.0%(GC))SET8 (C18B7) Rabbit mAb2,2-二甲基琥珀酸酐

綿羊5羥色/血清素/血清(5HT/ST)ELISA試劑盒PAK2  p21激活激酶2100 ul

綿羊5羥二十碳四酸(5-HE)ELISA試劑盒PAI-1  纖溶酶原激活物抑制因子20 ul

綿羊3-硝基酪氨酸(3-NT)ELISA試劑盒PAK4  p21激活激酶4100 ul

綿羊Ⅱ型膠原(Col Ⅱ)ELISA試劑盒Phospho-PAK4 (Ser474)/PAK5 (Ser602)/PAK6 (Ser560)  酸化p21激活激酶4、5、6100 ul

綿羊17羥孕酮(17-OHP)ELISA試劑盒Phospho-PAK4 (Ser99)  酸化p21激活激酶4100 ul

貓ELISA試劑盒PAI-2  纖溶酶原激活物抑制因子2100 ul

貓腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒phosphor-PAK1+PAK2+PAK3 (Ser141)  酸化p21激活激酶1/2/3100 ul

貓孕激素/孕酮(PROG)ELISA試劑盒Phospho-PAK1 (Ser199/204)/PAK2 (Ser192/197)  酸化p21激活激酶1/2100 ul

貓游離*狀腺原氨酸(Free-T3)ELISA試劑盒Phospho-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402)  酸化p21激活激酶1/2100 ul
魚(yú)特定基因序列PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)細胞質(zhì)多聚腺苷酸結合蛋白3抗體4'-Hydroxy-2-O-methylanigorufone中文名：別名：分子式：C20H14O3

Complexin I/復合素1抗體2-O-Methylanigorufone中文名：別名：2-Methoxy-9-phenylphenalen-1-one分子式：C20H14O2

CD30抗體2-Methoxyphenalen-1-one中文名：別名：分子式：C14H10O2

細胞角蛋白19，17，14，42，10抗體3',4'-Dihydroxy-2-O-methylanigorufone中文名：別名：分子式：C20H14O4

細胞角蛋白10抗體Musellactone中文名：別名：分子式：C13H12O4