CTSH組織蛋白酶HELISA試劑盒

標本要求：

1．標本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻進(jìn)行，提取后應盡快進(jìn)行實(shí)驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

產(chǎn)品屬性：

需要而未提供的試劑和器材：

1. 產(chǎn)品僅用于科研標準規格酶標儀

2. 高速離心機

3. 電熱恒溫培養箱

4. 干凈的試管和Eppendof管

5. 系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時(shí)，用多通道移液器

6. 蒸餾水，容量瓶等。

備試劑與收集血樣：

1.  收集標本：血清、血漿（EDTA 、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細胞培養上清液、組織勻漿等盡早檢測， 2-8 ℃ 保存48 小時(shí)；更長(cháng)時(shí)間須冷凍（ -20   ℃或 -70   ℃ ）保存，避免反復凍融。

2.  標準品液配制：使用前加入0.5ml 蒸餾水 混勻，配成 120 0ng/ml 的溶液 。 設標準 管 8 管，管加標本稀釋液 900ul ，第二至第八管加入標本稀釋液 500ul 。在管中加入 120 0ng/ml 的標準品溶液 100ul 混勻后用加樣器吸出 500ul ，移至第二管 。如此反復作對倍稀釋?zhuān)瑥牡谄?管 中吸出 500ul 棄去。第八 管 為空白對照。

3.  10× 標本稀釋液用蒸餾水作 1: 1 0 倍稀釋?zhuān)?示例： 1ml濃稀釋液 +9ml 蒸餾水）。

4.  洗滌液：用重蒸水 1:20 稀釋?zhuān)ㄊ纠?ml 濃縮洗滌液加入 19ml 的重蒸水）

檢測程序：

1.  加樣：每孔各加入標準品或待測樣品 100ul ，將反應板充分混勻后置 37 ℃ 120 分鐘。

2.  洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌 4-6 次，向濾紙上印干。

3.  每孔中加入抗體工作液10 0ul 。將反應板充分混勻后置 37 ℃ 6 0 分鐘。

4.  洗板：同前。

5.  每孔加酶標抗體工作液100ul 。將反應板置 37 ℃ 3 0 分鐘。

樣本實(shí)驗前準備：

ELISA試劑盒液體樣本：包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養上清等。

（1）血清

室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。

（2）血漿：

應根據標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。

（3）尿液：

用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實(shí)行。

（4）細胞培養上清：

檢測分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。

（5）培養細胞

檢測細胞內的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。

（6）組織標本

切割標本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

操作步驟：

1.標準品的稀釋?zhuān)罕驹噭┖刑峁┰稑藴势芬恢?，用?hù)可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7.溫育：操作同3。

8.洗滌：操作同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時(shí)藍色立轉黃色）。

11. 測定：以空白空調零，450nm波長(cháng)依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以?xún)冗M(jìn)行。

可溶性CD30配體(sCD30L)試劑盒 大黃素固紅TR半化鋅鹽 90%聚乙二單 平均分子量1000

可溶性CD30配體(sCD30L)試劑盒 大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷固紫B鹽 80%蒽 AR

正常T表達和分泌因子(RANTES/CCL5)試劑盒 大黃素N-酰-L-硫氨酰-L-白氨酰-L苯氨 97%N-乙酰-D-半乳糖，水合 98%

正常T表達和分泌因子(RANTES/CCL5)試劑盒 大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷(S)-(-)-2-酰琥珀酐 90%,工業(yè)級偶氮二二異酯 95%

P選擇素(P-Selectin/CD62P/GMP140)試劑盒大黃素葡萄糖苷D-果糖-6-磷二鈉，二水 98%偶氮二二叔丁酯 98%

P選擇素(P-Selectin/CD62P/GMP140)試劑盒大黃鈣熒光探針FIuo,3-AM 70%4,4-二溴聯(lián)苯  98%

血血小板衍生生長(cháng)因子AB(PDGF-AB)試劑盒大黃-8-O-β-D-葡萄糖苷熒蒽 分析標準品3'-羥苯乙 98%

血血小板衍生生長(cháng)因子AB(PDGF-AB)試劑盒大戟二烯D-半乳糖 分析標準品硫素 USP級,680 I.U./mg

血血小板衍生生長(cháng)因子可溶性受體α(PDGFsR-α)試劑盒大戟因子L1羥乙酰 98%

血血小板衍生生長(cháng)因子可溶性受體α(PDGFsR-α)試劑盒大薊苷三油甘油酯 99%異苯酯 99%（劇品）

神經(jīng)營(yíng)養因子4(NT-4)試劑盒酰戊二酰 97%鄰硝苯 99%

神經(jīng)營(yíng)養因子4(NT-4)試劑盒大麥芽甘草次（α型） 分析標準品，>98%對硝苯 99%

神經(jīng)營(yíng)養因子3(NT-3)試劑盒N-(γ-L-谷氨酰）-1-萘 BR間硝苯 CP

神經(jīng)營(yíng)養因子3(NT-3)試劑盒大葉茜草素L-甘油鈣鹽，一水 97%間硝苯 分析標準品

的神經(jīng)生長(cháng)因子(NGF)試劑盒 丹參素DL-甘油 90%間硝苯 standard for GC, ≥99.5% (GC)

的神經(jīng)生長(cháng)因子(NGF)試劑盒 丹參素鈉甘氨脫氧膽 97%間硝苯標準溶液 1000μg/ml，溶劑：
CTSH組織蛋白酶HELISA試劑盒產(chǎn)品背景：

細胞凋亡是細胞的基本特征之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復、內環(huán)境的穩定和一些疾病發(fā)生過(guò)程等方面起著(zhù)十分重要的作用。

在正常細胞中，磷脂酰絲氨suan(PS)只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨suan(PS)由脂膜內側翻向外側。在體內，巨噬細胞可以識別翻轉到細胞膜表面的PS 從而將這些程序性死亡的細胞清除，因此凋亡過(guò)程中并不伴隨局部的炎癥反應，而在細胞壞死的過(guò)程中則常常伴隨著(zhù)炎癥反應。

AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結合蛋白，能與細胞凋亡過(guò)程中翻轉到膜外的PS 高親和力特異性結合。PS 外翻發(fā)生在細胞核破裂，DNA 片段化以及凋亡相關(guān)蛋白出現之前，這使得Annexin V 與PS的結合成為凋亡早期的一種重要檢測標志事件。

檢測原理：

在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨suan(phosphotidylserine，PS)位于細胞膜的內側，但在早期凋亡的細胞中，PS 從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。

Annexin-Ⅴ能與PS 高親和力結合?？赏ㄟ^(guò)細胞外側暴露的磷脂酰絲氨suan與凋亡早期細胞的胞膜結合。用標記了APC的AnnexinⅤ作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。細胞壞死的過(guò)程中也會(huì )發(fā)生細胞膜損傷，壞死的細胞會(huì )結合Annexin V-APC。

Annexin V-APC 通常與細胞膜非滲透性核酸熒光染料聯(lián)合使用以檢測凋亡細胞。常用的染料是7-AAD。正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的，核酸染料7-AAD 不能透過(guò)完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，7-AAD 能夠透過(guò)細胞膜與細胞核結合呈現紅色。

7-AAD/Annexin V-APC試劑盒將Annexin Ⅴ與7-AAD匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及死細胞區分開(kāi)來(lái)。壞死細胞可以同時(shí)與Annexin V-APC和7-AAD 結合顯色，而7-AAD 則被排除在活細胞(APC陰性)和早期凋亡細胞(APC陽(yáng)性)之外。在沒(méi)有巨噬細胞的情況下，凋亡的后階段會(huì )像細胞壞死一樣發(fā)生整個(gè)細胞的解體，從而使凋亡晚期的細胞也同時(shí)被APC和7-AAD 結合染色呈現雙陽(yáng)性。

儲存條件：染色液2-8℃避光保存；結合液2-8℃保存；長(cháng)期不用-20℃保存。

Annexin V-APC染色液避免反復凍融，凍融2次以上可能會(huì )失效。長(cháng)期保存分裝后-20℃保存。

有效期：一年。