破傷風(fēng)芽孢梭菌PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)

注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時(shí)間；4．循環(huán)次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
化銨(>99%,BR)IL-2Rα/CD25 (D6K5F) Rabbit mAb6-甲基煙酰

十二水合硫酸鐵銨(>98%,BR)LXR-β (D6M9D) Rabbit mAb5-尿苷

鉬酸銨四水Spartin AntibodyN-1-Boc-N-Cbz-2-哌甲酸

硫酸鎳銨六水(>98%,BR)Asymmetric Di-Methyl Arginine Motif [adme-R] MultiMab™ Rabbit mAb mix(S)-2-甲基吡咯烷

鉬酸銨(>96.5%,BR)Phospho-Rpb1 CTD (Ser5) (D9N5I) Rabbit mAb2-氨基-5-溴吡啶-羧酸

酸氫銨鈉(>98%,BR)Rad23B (D4W7F) Rabbit mAb5-噻唑-2-磺酰

丁二酸銨(>98%,BR)RIP3 (E1Z1D) Rabbit mAb芐

硫代硫酸銨IFITM2 Antibody2-氟-5-三氟甲酸

鹽酸氨啉(>99%,BP)Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb二甲氨基

[N-(1,1-二甲基-2-羥基)]氨基-2-羥烷磺酸鈉鹽(>98%,BP)TRIB2 (D8P2X) Rabbit mAb氨基異丁酸水合物

對甲氧基甲(>97%,BR)Acetyl-Histone H4 (Lys16) (E2B8W) Rabbit mAb對羥基肉桂酸酯（順?lè )椿旌衔铮?/span>

銻(>98%,BR)Non-phospho (Active) β-Canin (Ser33/37/Thr41) (D13A1) Rabbit mAb (PE Conjuga)-1-

五(>99%,BR)DAX1 (D2F1) Rabbit mAb叔丁氧羰?；i氨酸

過(guò)硫酸銨PVR/CD155 (D3G7H) Rabbit mAb6-溴-2-萘甲酸

甲亞鹽(>95%，BR)Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/Ser5) (D1G3K) Rabbit mAb2-溴-吡啶甲

天青C(>50%,BS)Griess Reagent Nitri Measurement Kit異丁酸橙花酯

酸鋇一水(>99%,BR)Prolactin Receptor (D4A9) Rabbit mAb甲氨蝶呤

硫酸鋇(>98%,BR)Mios (D12C6) Rabbit mAb1,5-二氟-2,二

谷氨酸[NMDA]受體亞基ε-2(NR-2)ELISA試劑盒GP65/SDFR1/NPTN  間質(zhì)細胞衍化因子受體1100 ul

谷氨酸[NMDA]受體亞基ε-2(NR-2)ELISA試劑盒GPA33  糖蛋白A33100 ul

孤腓肽(OFQ/N)ELISA試劑盒GNLY/NKG5  顆粒溶素100 ul

鉤端螺旋體IgM(Lebtospira)ELISA試劑盒GPNMB/Osoactivin  GPNMB100 ul

鉤端螺旋體IgG(Leptospira)ELISA試劑盒g(shù)lypican 1  脂?；嫉鞍拙厶?1100 ul

弓蛔蟲(chóng)(Tc)(IgG)ELISA試劑盒g(shù)lypican 3/GPC3  脂?；嫉鞍拙厶?320 ul

庚型肝炎病毒(IgM)ELISA試劑盒Glypican 4  脂?；嫉鞍拙厶?4100 ul

庚型肝炎病毒(HGV)抗原ELISA試劑盒Glycodelin A/PP14  胎盤(pán)蛋白14100 ul

庚型肝炎病毒(HGV)(IgG)ELISA試劑盒Glucocorticoid receptor  糖皮質(zhì)激素受體100 ul
破傷風(fēng)芽孢梭菌PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)紅細胞生成素受體抗體1-Allyl-3,5-Dimethylpyrazole中文名：1-烯丙基-3,5-二甲基吡唑別名：分子式：C8H12N2

酪氨酸蛋白激酶A4受體抗體(1R,2S)-2-Ami-1,2-diphenylethal中文名：(1R,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇別名：分子式：C14H15

表皮生長(cháng)因子受體3抗體5,6-Dimethyl-2-Benzothiazolamine中文名：5,6-二甲基-2-苯并噻唑胺別名：分子式：C9H10N2S

蛋白激酶R抗體Acyclovir中文名：阿昔洛韋別名：分子式：C8H11N5O3

EHM2蛋白抗體5-Ami-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one中文名：5-氨基苯并咪唑酮別名：分子式：C7H7N3O
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。